Coñecéronse as secuencias xenómicas da maioría dos virus.Sondas de ácidos nucleicos que son segmentos curtos de ADN deseñados para hibridarse con ADN viral ou segmentos de ARN complementarios.A reacción en cadea da polimerase (PCR) é unha técnica máis eficiente para a detección de virus.Recentemente desenvolvéronse métodos de diagnóstico de alto rendemento.
A. Técnica de hibridación de ácidos nucleicos
A hibridación de ácidos nucleicos, incluíndo principalmente a transferencia Southern (Southern) e Northern blotting (Northern), é unha nova técnica de rápido desenvolvemento no campo do diagnóstico de virus.A razón de ser do ensaio de hibridación é utilizar segmentos curtos de ADN (chamados "sonda") deseñados para hibridar con segmentos complementarios de ADN ou ARN viral.Por quecemento ou tratamento alcalino, o ADN ou o ARN diana de dobre cadea sepáranse en cadeas simples e despois inmóbilse nun soporte sólido.Despois diso, engádese a sonda e hibridízase co ADN ou ARN diana.Como a sonda está marcada con isótopo ou nucleido non radioactivo, o ADN ou ARN diana pódese detectar mediante autorradiografía ou mediante o sistema biotina-avidina.Dado que a maioría dos xenomas virais foron clonados e secuenciados, pódense detectar mediante secuencias específicas de virus como sondas no espécime.Actualmente, os métodos de hibridación inclúen: dot blot, hibridación in situ en células, DNA blotting (DNA) (Southern blot) e ARN blotting (ARN) (Northern blot).
B. Tecnoloxía PCR
Nos últimos anos desenvolvéronse unha serie de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro baseadas na PCR, para probar virus insensibles ou non cultivables.A PCR é un método que pode sintetizar secuencias específicas de ADN mediante reaccións de polimerase in vitro.O proceso de PCR inclúe un ciclo térmico de tres pasos: desnaturalización, recocido e extensión A alta temperatura (93℃~95℃), o ADN de dobre cadea sepárase en dúas cadeas simples de ADN;a continuación, a baixa temperatura (37 ℃ ~ 60 ℃), dous cebadores de nucleótidos sintetizados se hibridan aos segmentos de ADN complementarios;mentres que á temperatura adecuada para o encima Taq (72 ℃), a síntese de novas cadeas de ADN comeza a partir do extremo 3' do cebador usando ADN complementario como moldes e nucleótidos únicos como materiais.Así, despois de cada ciclo, unha cadea de ADN pódese amplificar en dúas cadeas.Repetindo este proceso, cada cadea de ADN sintetizada nun ciclo pode usarse como molde no ciclo seguinte, e o número de cadeas de ADN duplícase en cada ciclo, o que significa que a produción de PCR se amplifica a unha velocidade logarítmica de 2n.Despois de 25 a 30 ciclos, a produción de PCR identifícase mediante electroforese e os produtos específicos do ADN pódense observar baixo luz UV (254 nm).Pola súa vantaxe de especificidade, sensibilidade e comodidade, a PCR adoptouse no diagnóstico clínico de moitas infeccións virais como o VHC, o VIH, o CMV e o VPH.Como a PCR é moi sensible, pode detectar o ADN do virus a nivel de fg, a operación debe realizarse con moito coidado para evitar falsos positivos.Ademais, un resultado positivo na proba de ácido nucleico non significa que haxa virus infeccioso vivo na mostra.
Coa ampla aplicación da técnica de PCR, desenvólvense novas técnicas e métodos baseados na técnica de PCR para diferentes fins de proba.Por exemplo, a PCR cuantitativa en tempo real pode detectar a carga viral;A PCR in situ úsase para identificar a infección por virus en tecidos ou células;A PCR aniñada pode aumentar a especificidade da PCR.Entre eles, a PCR cuantitativa en tempo real desenvolveuse máis rapidamente.Moitas técnicas novas, como a sonda de hidrólise TaqMan, a sonda de hibridación e a sonda de baliza molecular, combináronse na técnica de PCR cuantitativa en tempo real, que se utiliza amplamente na investigación clínica.Ademais de identificar con precisión a carga viral no fluído corporal dos pacientes, este método tamén se pode usar para detectar mutantes tolerantes aos fármacos.Polo tanto, a PCR cuantitativa en tempo real aplícase principalmente na avaliación de efectos curativos e na vixilancia da tolerancia ás drogas.
C. Detección de alto rendemento de ácidos nucleicos virais
Para satisfacer as necesidades de diagnóstico rápido de novas enfermidades infecciosas emerxentes, establecéronse varios métodos de detección de alto rendemento, como chips de ADN (ADN).Para os chips de ADN, as sondas específicas sintetízanse e únense a pequenos chips de silicio de moi alta densidade para formar microarrays de sondas de ADN (ADN) que poden hibridarse coa mostra.O sinal de hibridación pódese capturar mediante un microscopio confocal ou un escáner láser e procesarse posteriormente polo ordenador e obter un enorme conxunto de datos relativos a diferentes xenes.Hai dous tipos de chip de ADN.O "chip de síntese" é o seguinte: os oligonucleótidos específicos sintetízanse directamente nos chips.Outro é o chip pool de ADN.Os xenes clonados ou os produtos da PCR están impresos ordenadamente na diapositiva.A vantaxe da tecnoloxía de chips de ADN é a detección simultánea dunha gran cantidade de secuencias de ADN.A última versión do chip de detección de patóxenos pode identificar máis de 1700 virus humanos á vez.A tecnoloxía do chip de ADN resolveu os problemas dos métodos tradicionais de hibridación de ácidos nucleicos e ten aplicacións moi amplas no diagnóstico viral e estudo epidemiolóxico.
Hora de publicación: 23-12-2020